Протеиновые инвестиции

Введение

Общие компоненты бесклеточной реакции включают клеточный экстракт, источник энергии, запас аминокислот , кофакторов, таких как магний , и ДНК с желаемыми генами . Клеточный экстракт получают путем лизирования интересующей клетки и центрифугирования клеточных стенок, генома ДНК и других остатков. Остатки представляют собой необходимый клеточный аппарат, включая рибосомы , аминоацил-тРНК синтетазы , факторы инициации трансляции и удлинения , нуклеазы и т. Д.

В CFPS можно использовать два типа ДНК: плазмиды и матрицы линейной экспрессии (LET). Плазмиды имеют круглую форму и образуются только внутри клеток. LET могут быть сделаны намного эффективнее с помощью ПЦР , которая реплицирует ДНК намного быстрее, чем выращивание клеток в инкубаторе . Хотя LET проще и быстрее сделать, выход плазмид обычно намного выше в CFPS. Из-за этого многие исследования сегодня сосредоточены на оптимизации выходов ЛПЭ CFPS, чтобы приблизиться к выходам CFPS с плазмидами.

Источник энергии — важная часть бесклеточной реакции. Обычно для реакции в экстракт добавляют отдельную смесь, содержащую необходимый источник энергии, а также запас аминокислот. Обычными источниками являются пируват фосфоенола , ацетилфосфат и креатинфосфат .

Типы бесклеточных систем

Обычные клеточные экстракты, используемые сегодня, производятся из E. coli (ECE), ретикулоцитов кролика (RRL), зародышей пшеницы (WGE), клеток насекомых (ICE) и дрожжевых Kluyveromyces ( система D2P ). Все эти экстракты коммерчески доступны.

ЕЭК — самый популярный лизат по нескольким причинам. Это самый недорогой экстракт, и его создание требует минимальных затрат времени. Кроме того, большие количества E. coli легко выращиваются, а затем легко лизируются с помощью гомогенизатора или ультразвукового устройства . ECE также обеспечивает самый высокий выход белка. Однако продукция с высоким выходом может ограничивать сложность синтезируемого белка, особенно в посттрансляционной модификации . В этом отношении могут быть предпочтительны менее эффективные эукариотические системы при условии, что модифицирующие ферментные системы сохраняются в экстрактах.

У каждой эукариотической системы есть свои преимущества и недостатки. Например, экстракт WGE дает самый высокий выход из трех экстрактов эукариот; однако он не так эффективен для некоторых посттрансляционных модификаций, таких как гликозилирование . При выборе экстракта следует учитывать тип посттрансляционной модификации, желаемые урожаи и стоимость.

Элонгация

— она включает все реакции от момента образования первой пептидной связи до присоединения последней аминокислоты. На рибосоме  имеется два участка  для связывания  двух молекул т-РНК.  В одном участке-пептидильном( П) находится первая т-РНК с аминокислотой метионин и с него  начинается  синтез любой молекулы белка. Во второй участок рибосомы- аминоацильный (А ) поступает вторая молекула  т-РНК и присоединяется к своему кодону. Между метионином и второй аминокислотой образуется пептидная связь. Вторая т-РНК перемещается вместе со своим кодоном м-РНК в пептидильный центр. Перемещение т-РНК с полипептидной цепочкой из аминоацильного центра в пептидильный   сопровождается продвижением рибосомы по м-РНК на шаг, соответствующий одному кодону. Т-РНК, доставившая метионин, возвращается в цитоплазму, амноацильный центр освобождается.  В него поступает новая т-РНК с аминокислотой, зашифрованной  очередным кодоном. Между третьей и второй аминокислотами образуется пептидная связь и третья т-РНК вместе с кодоном м-РНК перемещается в пептидильный центр  .Процесс элонгации, удлинения белковой цепи.  Продолжается до тех пор, пока в рибосому не попадёт один из трёх кодонов, не кодирующих аминокислоты. Это кодон —  терминатор и для него не существует  соответствущей  т-РНК , поэтому ни одна из т-РНК не может занять место в аминоацильном центре.

Терминация

– завершение синтеза полипептида. Она связана с узнаванием специфическим рибосомным белком одного из терминирующих кодонов (УАА, УАГ, УГА), когда он будет входить в аминоацильный центр.  К рибосоме присоединяется специальный фактор терминации, который способствует разъединению субъединиц рибосомы и освобождению синтезированной молекулы белка. К  последней аминокислоте пептида присоединяется  вода и её карбоксильный конец отделяется от т-РНК.

Сборка пептидной цепи осуществляется с большой скоростью. У бактерий при температуре 37°С она выражается в добавлении к полипептиду от 12 до 17 аминокислот в секунду. В эукариотических клетках к полипептиду добавляется две аминокислоты в одну секунду.

Синтезированная полипептидная цепь затем поступает в комплекс Гольджи, где завершается построение белковой молекулы (последовательно возникают вторая, третья, четвертая структуры). Здесь же происходит комплексование белковых молекул с жирами и углеводами.

Весь процесс биосинтеза белка представлен в виде схемы: ДНК про иРНК мРНК полипептидная цепь белок комплексование белков и их преобразование в функционально активные молекулы.

Этапы реализации наследственной информации также протекают сходным образом: сначала она транскрибируется в нуклеотидную последовательность мРНК, а затем транслируется в аминокислотную последовательность полипептида на рибосомах с участием тРНК.

Транскрипция эукариот осуществляется под действием трех ядерных РНК-полимераз. РНК-полимераза 1 находится в ядрышках и отвечает за транскрипцию генов рРНК. РНК-полимераза 2 находится в ядерном соке и отвечает за синтез предшественника мРНК. РНК-полимераза 3 –небольшая фракция в ядерном соке, которая осуществляет синтез малых рРНК и тРНК. РНК-полимеразы специфически узнают нуклеотидную последовательность транскрипции-промотор. Эукариотическая мРНК вначале синтезируется в виде предшественницы (про- иРНК), на нее списывается информация с экзонов и интронов. Синтезированная мРНК обладает большими, чем необходимо для трансляции размерами и оказывается менее стабильной.

В процессе созревания  молекулы мРНК с помощью ферментов рестриктаз вырезаются интроны, а с помощью ферментов – лигаз  сшиваются экзоны. Созревание мРНК называется процессингом, сшивание экзонов называется сплайсингом. Таким образом, зрелая мРНК содержит только экзоны и она значительно короче её предшественницы – про- иРНК. Размеры интронов варьируют от 100 до 10000 нуклеотидов и более. На долю интонов приходится около 80% всей незрелой мРНК. В настоящее время доказана возможность альтернативного сплайсинга, при котором из одного первичного транскрипта могут удаляться в разных его участках нуклеотидные последовательности и будут образовываться несколько зрелых мРНК. Данный вид сплайсинга характерен в системе генов иммуноглобулинов у млекопитающих, что даёт возможность формировать на основе одного транскрипта мРНК разные виды антител. По завершению процессинга зрелая мРНК проходит отбор перед выходом в цитоплазму из ядра. Установлено, что попадает всего 5% зрелой мРНК, а остальная часть расщепляется в ядре. Преобразование первичных транскриптонов эукариотических генов, связанное с их экзон-интронной организацией, и в связи с переходом зрелой мРНК из ядра в цитоплазму, определяет особенности реализации генетической информации эукариот. Следовательно, мозаичный ген эукариот не является геном цистроном, так как не вся последовательность ДНК используется для синтеза белка.

Биосинтез Белка

Подробности

Категория: Биология

Документальные учебные фильмы. Серия «Биология».

https://vk.com/video_ext.php

 Информационная РНК (рибонуклеиновая кислота), несущая сведения о первичной структуре белковых молекул, синтезируется в ядре. Пройдя через поры ядерной оболочки, и-РНК направляется к рибосомам, где осуществляется расшифровка генетической информации — перевод ее с «языка» нуклеотидов на «язык» аминокислот.

 Аминокислоты, из которых синтезируются белки, доставляются к рибосомам с помощью специальных РНК, называемых транспортными (т-РНК). Эти небольшие молекулы, состоящие из 70-90 нуклеотидов, способны сворачиваться таким образом, что образуют структуры, напоминающие по форме лист клевера. В клетке имеется столько же разных типов т-РНК, сколько типов кодонов, шифрующих аминокислоты. На вершине каждого «листа» т-РНК имеется последовательность трех нуклеотидов, комплементарных нуклеотидам кодона в и-РНК. Такая последовательность нуклеотидов в структуре т-РНК называется антикодоном. Специальный фермент «узнает» антикодон и присоединяет к «основанию листа» т-РНК не какую угодно, а определенную, «свою» аминокислоту. В этом состоит первый этап синтеза. Для того чтобы аминокислота включилась в цепь белка, она должна оторваться от т-РНК. На втором этапе синтеза белка т-РНК выполняет функцию переводчика с «языка» нуклеотидов на «язык» аминокислот. Такой перевод происходит на рибосоме. В ней имеется два участка. на одном т-рНК получает команду от и-РНК — антикодон узнает кодон, на другом — выполняется приказ — аминокислота отрывается от т-РНК.

 Третий этап синтеза белка заключается в том, что фермент синтеза присоединяет оторвавшуюся от т-РНК аминокислоту к белковой молекуле. Информационная РНК непрерывно скользит по рибосоме, каждый триплет сначала попадает в первый участок, где узнается антикодоном т-РНК, затем на второй участок. Сюда же переходит т-РНК с присоединенной к ней аминокислотой, здесь аминокислоты отрываются от т-РНК и соединяются друг с другом в той последовательности, в которой триплеты следуют один за другим.

Схема биосинтеза белка. Когда на рибосоме в первом участке оказывается один из трех триплетов, являющихся знаками препинания между генами, это означает, что синтез белка завершен. Готовая цепь белка отходит от рибосомы. Процесс синтеза белковой молекулы требует больших затрат энергии. На соединение каждой аминокислоты с т-РНК расходуется энергия одной молекулы АТФ. Средний по размерам белок состоит из 500 аминокислот, следовательно, столько же молекул АТФ расщепляется в процессе его синтеза. Кроме того, энергия нескольких молекул АТФ нужна для движения и-РНК по рибосоме.

 Для увеличения производства белков и-РНК часто одновременно проходит не через одну, а через несколько рибосом последовательно. Такую структуру, объединенную одной молекулой и-РНК, называют полисомой. На каждой рибосоме в таком, похожем на нитку бус, конвейере последовательно синтезируются несколько молекул одинаковых белков.

Синтез белков на полисоме.

 Аминокислоты бесперебойно поставляются к рибосомам с помощью т-РНК. Отдав аминокислоту, молекула т-РНК тут же соединяется с другой такой же аминокислотой. Высокая слаженность всех «служб комбината» по производству белков позволяет в течение нескольких минут синтезировать молекулы, состоящие из сотен аминокислот. Синтез белка на рибосомах носит название трансляции.

Этапы трансляции

Трансляция состоит из трех этапов: инициации, элонгации и терминации.

1. Инициация — сборка комплекса, участвующего в синтезе полипептидной цепи. Малая субчастица рибосомы соединяется с инициаторной мет-тРНК, а затем с мРНК, после чего происходит образование целой рибосомы, состоящей из малой и большой субчастиц.
2. Элонгация — удлинение полипептидной цепи. Рибосома перемещается вдоль мРНК, что сопровождается многократным повторением цикла присоединения очередной аминокислоты к растущей полипептидной цепи.
3. Терминация — завершение синтеза полипептидной молекулы. Рибосома достигает одного из трех стоп-кодонов мРНК, а так как не существует тРНК с антикодонами, комплементарными стоп-кодонам, синтез полипептидной цепи прекращается. Она высвобождается и отделяется от рибосомы. Рибосомные субчастицы диссоциируют, отделяются от мРНК и могут принять участие в синтезе следующей полипептидной цепи.

Синтез белков и инсулин

В инсулине 51 аминокислота. Чтобы соединить их в нужной последовательности, химикам потребовалось провести 223 реакции. Когда спустя три года после начала первой из них была закончена последняя, выход продукта составлял меньше одной сотой процента. Три года, 223 стадии, сотая доля процента — согласитесь, победа носит чисто символический характер. Говорить о практическом применении этого метода очень трудно: слишком велики связанные с его реализацией расходы

А ведь в конечном счете речь идет о синтезе не драгоценных реликвий славы органической химии, а о выпуске жизненно важного лекарственного препарата, который необходим тысячам людей во всем мире. Так классический метод синтеза полипептидов исчерпал себя на первом же, самом простом белке

Значит, «синяя птица» вновь ускользнула из рук химиков?

Ограничения

Одной из проблем, связанных с CFPS, является деградация ДНК эндогенными нуклеазами в клеточном экстракте. Это особенно проблематично с LET. В клетках есть эндонуклеазы , атакующие случайные участки цепей ДНК; однако гораздо чаще встречаются экзонуклеазы, атакующие ДНК с концов. Поскольку плазмиды имеют круглую форму и не имеют конца, к которому могут присоединяться экзонуклеазы, последние на них не влияют. Однако ЛЭП подвержены обоим. Из-за уязвимости LET многие исследования сегодня сосредоточены на оптимизации выходов LET CFPS, чтобы приблизиться к выходам CFPS с использованием плазмид.

Одним из примеров этой улучшенной защиты с помощью плазмид является использование бактериофага лямбда . Gam является ингибитором RecBCD , экзонуклеазы, обнаруженной в Escherichia coli ( E. coli ). При использовании гамма-излучения выходы CFPS с LET были значительно увеличены и были сопоставимы с выходами CFPS с плазмидами. Также могут быть получены экстракты PURE, устраняющие опасения, связанные с экзонуклеазами. Эти экстракты дороги в производстве и в настоящее время не являются экономичным решением проблемы экзогенной деградации ДНК.

Новый метод синтеза белка

Примерно за полтора года до того, как мир узнал о синтезе инсулина, в печати промелькнуло еще одно сообщение, которое вначале не привлекло особого внимания: американский ученый Р. Мэрифилд предложил новый метод синтеза пептидов. Поскольку сам автор поначалу не дал методу должной оценки, и в нем было много недоработок, выглядел он в первом приближении даже хуже существовавших. Однако уже в начале 1964 года, когда Мэрифилду удалось с помощью своего метода осуществить полный синтез 9-членного гормона с полезным выходом в 70%, ученые изумились: 70% после всех этапов — это 9% полезного выхода на каждой стадии синтеза.

Основная идея нового метода заключается в том, что растущие цепочки пептидов, которые раньше были брошены на произвол хаотического движения в растворе, теперь привязывались одним концом к твердому носителю — их как бы заставляли стать на якорь в растворе. Мэрифилд брал твердую смолу и к ее активным группам «привязывал» за карбонильный конец первую из собираемых в пептид аминокислоту. Реакции шли внутри отдельных частичек смолы. В «лабиринтах» ее молекул сначала появлялись первые короткие ростки будущего пептида. Затем в сосуд вводили вторую аминокислоту, ее молекулы сшивались своими карбонильными концами со свободными аминными концами «привязанной» аминокислоты, и в частицах вырастал еще один «этаж» будущего «здания» пептида. Так, этап за этапом, постепенно наращивался весь пептидный полимер.

Новый метод имел несомненные преимущества: прежде всего в нем была решена проблема отделения ненужных продуктов после присоединения каждой очередной аминокислоты — эти продукты легко смывались, а пептид оставался пришитым к гранулам смолы. Одновременно исключалась проблема растворимости растущих пептидов — один из главных бичей старого метода; раньше они нередко выпадали в осадок, практически переставая участвовать в процессе роста. Пептиды, «снимаемые» после окончания синтеза с твердой подложки, получались почти все одинакового размера и строения, во всяком случае, разброс в структуре был меньше, чем при классическом методе. И соответственно больше полезный выход. Благодаря этому методу синтез пептидов — кропотливый, трудоемкий синтез — легко поддается автоматизации.

Мэрифилд соорудил несложный автомат, который сам по заданной программе проделывал все положенные операции — подачу реагентов, смешивание, слив, промывку, отмер дозы, добавление новой порции и так далее. Если по старому методу на присоединение одной аминокислоты приходилось травить 2—3 дня, то Мэрифилд на своем автомате соединял за день 5 аминокислот. Разница — в 15 раз.

Синтез белка из аминокислот

В течение последующих лет был предложен ряд так называемых мягких методов «сшивки» аминокислот друг с другом. Однако все они фактически были лишь вариациями на тему метода Фишера. Вариациями, в которых иногда даже трудно было уловить исходную мелодию. Но сам принцип оставался все тем же. И все теми же оставались трудности, связанные с защитой уязвимых групп. За преодоление этих трудностей приходилось расплачиваться увеличением числа стадий реакции: один элементарный акт — соединение двух аминокислот — распадался на четыре этапа. А каждая лишняя стадия — это неизбежные потери.

Если даже предположить, что каждая стадия идет с полезным выходом в 80% (а это хороший выход), то через четыре этапа эти 80% «растают» до 40%. И это при синтезе только дипептида! А если аминокислот будет 8? А если 51, как в инсулине? Прибавьте к этому сложности, связанные с существованием двух оптических «зеркальных» форм молекул аминокислот, из которых в реакции нужна только одна, приплюсуйте проблемы отделения образующихся пептидов от побочных продуктов, особенно в тех случаях, когда они одинаково растворимы. Что же получится в сумме: Дорога в никуда?

И все же эти трудности не останавливали химиков. Погоня за «синей птицей» продолжалась. В 1954 году были синтезированы первые биологически активные гормоны-полипептиды — вазопрессин и окситоцин. В них было по восемь аминокислот. В 1963 году был синтезирован 39-членный полипептид АКТГ — адренокортикотропный гормон. Наконец, химики США, Германии и Китая синтезировали первый белок — гормон инсулин.

Как же так, скажет читатель, трудная дорога, оказывается, привела не в никуда и не куда-нибудь, а к осуществлению мечты многих поколений химиков! Это же эпохальное событие! Верно, это — эпохальное событие. Но давайте оценим его трезво, отрешившись от сенсационности, восклицательных знаков и чрезмерных эмоций.

Никто не спорит: синтез инсулина — огромная победа химиков. Это колоссальный, титанический труд, достойный всякого восхищения. Но вместе с тем эго, по существу, и потолок старой химии полипептидов. Это победа на грани поражения.

Транскрипция

Процесс переписывания информации в ядре клетки с  участка молекулы ДНК на молекулу мРНК (иРНК) называется транскрипция (лат. Transcriptio – переписывание). Синтезируется первичный продукт гена- мРНК. Это первый этап белкового синтеза.    На соответствующем участке ДНК фермент РНК–полимераза узнает знак начала транскрипции – промотр . Стартовой точкой  считается первый нуклеотид ДНК, который включается ферментом в РНК-транскрипт. Как  правило, кодирующие участки начинаются кодоном АУГ, иногда у бактерий используется ГУГ. Когда РНК-полимераза связывается с промотором, происходит локальное расплетание двойной спирали ДНК и копируется одна из цепей по принципу комплементарности. Синтезируется мРНК, скорость сборки её достигает 50 нуклеотидов в секунду. По мере движения РНК–полимеразы ,  растёт цепь мРНК, и когда фермент достигнет конца копирующего участка  – терминатора, мРНК отходит от матрицы. Двойная спираль ДНК позади фермента восстанавливается.

Транскипция прокариот осуществляется в цитоплазме. В связи с тем, что ДНК  целиком состоит из кодирующих нуклеотидных последовательностей, поэтому синтезированная мРНК сразу  выполняет функцию матрицы для трансляции (см. выше).

Транскрипция мРНК у эукариот происходит в ядре. Она  начинается  синтезом  больших по размерам  молекул — предшественников (про-мРНК), называемых  незрелой , или ядерной РНК.Первичный продукт гена- про-мРНК  является точной копией транскрибированного участка ДНК, включает экзоны и интроны. Процесс формирования зрелых молекул РНК из предшественников  называется процессингом. Созревание мРНК  происходит путём сплайсинга – это  вырезания ферментами  рестриктаз   интронов и  соединение  участков с транскрибируемыми последовательностями  экзонов ферментами лигаз. ( Рис.).Зрелая мРНК значительно короче молекул-предшественников про – мРНК, размеры интронов  в них варьирует от 100 до 1000 нуклеотидов и более. На долю интронов приходится около 80% всей  незрелой  мРНК.

      В настоящее время доказана возможность  альтернативного сплайсинга, при котором  из одного первичного транскрипта могут удалятся в разных его участках нуклеотидные последовательности и будут образовываться  несколько зрелых мРНК. Данный вид сплайсинга характерен в системе генов иммуноглобулинов у млекопитающих , что даёт возможность формировать на основе одного транскрипта  мРНК разные виды антител.

По завершению процессинга зрелая мРНК проходит отбор перед выходом  из ядра. Установлено, что в  цитоплазму попадает всего 5%  зрелой мРНК  , а остальная часть расщепляется в ядре.

Где происходит синтез, описание

Рибосомы, их функции

Рибосомы — одни из самых важных немембранных органелл, т.е. составных компонент живых клеток. Бывают эллипсоидной и сферической формы. Рибосомы — это рибонуклеопротеидный комплекс, который состоит из двух субъединиц: малой и большой. Они могут существовать как вместе, так и раздельно. Для начала синтеза белка субъединицы должны находиться отдельно.

Малая субъединица связывает мРНК в начале трансляции и находит стартовый кодон. Потом включается в работу большая, и целая рибосома производит биосинтез белка. Участок, который заведует образованием пептидной связи, находится в большой субъединице.

Рибосомы отвечают за считывание информации с матричной РНК и присоединение к пептидной цепочке белка соответствующей аминокислоты. Их синтез происходит в ядрышке, специальной внутриядерной структуре.

Рибосомы могут быть расположены по одиночке в цитоплазме, ни к чему не прикрепляясь, но чаще всего они находятся на мембранах эндоплазматической сети.

Эндоплазматическая сеть (ЭПС)

Она еще называется эндоплазматический ретикулум (ЭПР). Это внутриклеточный органоид клетки эукариота, который выглядит как разветвлённая сеть из окружённых мембраной уплощённых полостей, канальцев, карманов и пузырьков. ЭПС не стабильная структура, подвержена частым изменениям.

Мембраны ЭПС морфологически идентичны и составляют единое целое с клеточным ядром. Они обеспечивают активный транспорт, т.е. перемещение от меньшей концентрации к большей ряда элементов. 

Трубочки ЭПС служат для связи между содержимым пузырьков, внешней средой и ядром. 

Всего выделяют два вида эндоплазматического ретикулума:

• гранулярный (шероховатый);
• агранулярный (гладкий).

На поверхности гранулярного находится большое количество рибосом. 

Функции ЭПС в биосинтезе белка — трансляция и транспорт. 

Откуда начинается процесс

В большинстве случаев признаки начала биосинтеза — когда рибосома узнает стартовый AUG-кодон, кодирующий метионин. Иначе этот процесс называется инициация. 

Биосинтез углеводов

Автотрофные организмы синтезируют подавляющее большинство углеводов. Они образуют из углекислого газа и воды шестиуглеродные моносахариды (гексозы). В ограниченном количестве из других органических соединений углеводы синтезируются в клетках гетеротрофных организмов.

В результате ферментативных реакций полисахариды образуются из моносахаридов. Биосинтез моносахаридов происходит двумя путями:

1) характерный автотрофным организмам, ведет к восстановлению С0₂ глюкозу;

2) благодаря ряду реакций из соединений неуглеводной природы (пировиноградной и молочной кислот, глицерина, некоторых аминокислот) образуется глюкоза.

Реакция матричного синтеза

В живых системах мы встречаемся с новым типом реакций, наподобие редупликации ДНК, или реакцией синтеза РНК. Такие реакции неизвестны в неживой природе. Их называют реакциями матричного синтеза.

Термином «матрица» в технике обозначают форму, употребляемую для отливки монет, медалей, типографского шрифта: затвердевший металл в точности воспроизводит все детали формы, служившей для отливки. Матричный синтез напоминает отливку на матрице: новые молекулы синтезируются в точном соответствии с планом, заложенным в структуре уже существующих молекул. Матричный принцип лежит в основе важнейших синтетических реакций клетки, таких, как синтез нуклеиновых кислот и белков. В этих реакциях обеспечивается точная, строго специфичная последовательность мономерных звеньев в синтезируемых полимерах. Здесь происходит направленное стягивание мономеров в определенное место клетки — на молекулы, служащие матрицей, где реакция протекает. Если бы такие реакции происходили в результате случайного столкновения молекул, они протекали бы бесконечно медленно. Синтез сложных молекул на основе матричного принципа осуществляется быстро и точно.

Роль матрицы в матричных реакциях играют макромолекулы нуклеиновых кислот ДНК или РНК. Мономерные молекулы, из которых синтезируется полимер, — нуклеотиды или аминокислоты — в соответствии с принципом комплементарности располагаются и фиксируются на матрице в строго определенном, заданном порядке. Затем происходит «сшивание» мономерных звеньев в полимерную цепь, и готовый полимер сбрасывается с матрицы. После этого матрица готова к сборке новой полимерной молекулы. Понятно, что как на данной форме может производиться отливка только какой-то одной монеты, одной буквы, так и на данной матричной молекуле может идти «сборка» только какого-то одного полимера.

Матричный тип реакций — специфическая особенность химизма живых систем. Они являются основой фундаментального свойства всего живого — его способности к воспроизведению себе подобного.

Преимущества и применение

CFPS имеет много преимуществ перед традиционным синтезом белков in vivo . В частности, бесклеточная реакция, включая приготовление экстракта, обычно занимает 1-2 дня, тогда как экспрессия белка in vivo может длиться 1-2 недели.

CFPS — открытая реакция. Отсутствие клеточной стенки позволяет напрямую управлять химической средой. Легко отбираются пробы, оптимизируются концентрации и можно отслеживать реакцию. Напротив, после того, как ДНК вставлена ​​в живые клетки, реакция не может быть доступна, пока она не закончится и клетки не будут лизированы.

Еще одно преимущество CFPS — отсутствие опасений по поводу токсичности. Некоторые желаемые белки и меченые белки токсичны для клеток при синтезе. Поскольку живые клетки не используются, токсичность продукта-белка не вызывает серьезного беспокойства.

Эти преимущества позволяют использовать множество приложений. Основное применение CFPS — включение неприродных аминокислот в белковые структуры (см. Расширенный генетический код ). Открытость реакции идеальна для вставки модифицированных тРНК и неприродных аминокислот, необходимых для такой реакции.

Синтетическая биология имеет много других применений и имеет светлое будущее в таких областях, как эволюция белков , наномашины , цепи нуклеиновых кислот и синтез вирусоподобных частиц для вакцин и лекарственной терапии .

Синтез мышечного белка после еды (постпрандиальный)

Cuthbertson et al. (5) применили метод эугликемического введения инсулина для выяснения различий дозозависимого влияния потребления аминокислот и гормонального воздействия на уровень синтеза мышечного белка у молодых и пожилых людей. Было показано, что потребление 40 г незаменимых аминокислот (эквивалент примерно 100 г высококачественного белка) не оказывает влияния на уровень синтеза белка у пожилых людей, в противоположность молодым (5). Интересно отметить, что стимуляция уровня синтеза была максимальной после потребления 10 г незаменимых аминокислот у молодых людей (5). Эти данные свидетельствуют, что стимуляция синтеза мышечного белка после приёма аминокислот существенно ухудшается с возрастом (снижается чувствительность к белковой нагрузке по сравнению с молодыми людьми).

Рис. 2. Потребление белка стимулирует белковый синтез. 

Тем не менее, множество вторичных факторов на пути от потребления белка до стимуляции синтеза может влиять на ситуацию, приводя по мере старения к анаболической резистентности.

Какой механизм лежит в основе снижения чувствительности к потреблению аминокислот или пищевого белка при старении? Нарушение усвоения белка и абсорбции аминокислот, ограничивающее проникновение аминокислот пищи в кровоток, является предположительным механизмом, который отвечает за понижение уровня синтеза белка после приёма пищи у пожилых людей (1). Более того, обнаружено, что спланхнический регион задерживает значительную часть потребляемых аминокислот после абсорбции кишечником у пожилых, но не у молодых людей (1,33). Это значит, что у пожилых людей меньше аминокислот может быть доступно для синтеза белка. Кроме того, есть доказательства понижения инсулинозависимого вовлечения капилляров и ограничение перфузии мышечных тканей после еды, что, в конечном счёте, уменьшает доставку аминокислот и возможно несёт ответственность за анаболическую резистентность мышц при старении (9,27,31). Например, Timmerman et al. (31) показали, что фармакологическое воздействие на кровообращение (приём нитропруссида натрия) во время введения инсулина улучшает микроциркуляцию и повышает уровень синтеза мышечных белков у пожилых людей.

Различия деятельности транспортёров аминокислот и последующего поглощения аминокислот мышцами между молодыми и пожилыми людьми может стать очередным местом возможных нарушений после потребления пищи (6). Предполагают, что активность определённых транспортёров аминокислот является связывающим звеном между постпрандиальной доступностью аминокислот и постпрандиальным синтезом мышечного белка. До сих пор влияние резких изменений экспрессии мРНК и белков этих транспортёров не текущую способность к транспорту аминокислот требует уточнения на человеческой модели. Фактически показано, что изменения экспрессии мРНК отдельных транспортёров аминокислот не зависят от концентрации циркулирующего лейцина (4,6) – переменной, которая рассматривается как важный модулятор синтеза мышечного белка после приёма пищи у стариков (24,35). «Мишень рапамицина у млекопитающих», комплекс 1 (mTORС1) действует как фундаментальное место интеграции анаболических сигналов, стимулирующих синтез мышечных белков скелетных мышц человека. Cuthbertson et al. (5) продемонстрировали, что концентрация белка mTORC1 и следующая цель в сигнальном пути p70S6K, отличается у здоровых молодых и пожилых людей. Различия в ключевых регуляторных белках могут обуславливать понижение способности аппарата синтеза мышечных белков «чувствовать» сигналы пищевых веществ в стареющих мышцах (5).

Другие исследователи сообщали о замедлении фофорилирования p70S6K в скелетных мышцах в ответ на внутривенное введение инсулина и аминокислот у пожилых людей по сравнению с молодыми, что может стать основой объяснения механизма возрастной анаболической резистентности (15)

Разумеется, любая корреляция между единичными измерениями уровня фосфорилирования анаболических сигнальных молекул и динамическими измерениями постпрандиального синтеза белка в мышцах может быть простым совпадением и к этим данным необходимо относиться с крайней осторожностью (13). Учитывая, что существует возрастное нарушение анаболических сигналов, эти наблюдения могут просто быть следствием вышеупомянутых проблем, вторичными процессами по отношению к доступности аминокислот для мышц

В целом, очевидно, что существуют различные процессы на разных уровнях, которые могут способствовать развитию возрастной анаболической резистентности.